Tak jsem se trochu nudil, tak třba to bude někomu užitečný kromě mě.

Klonování pro mě a ostatní debily: (AT klonování pomocí pGEM-T-Easy Vector Systém)

·         PCR

o   udělá se normální PCR

o   pokud máme PCR už hotovou neměla by být zmražená, spíš v lednici max. tak dvě tři noci

·         ELFO - 2 možnosti:

1.       Pustí se na normální ELFO na 1% gel (5 µl PCR produktu +1 µl loadovacího pufru ) a zjistíme, jestli je tam fragment co chceme

2.       Udělám 1,5% gel (0,9 g agarosy a 60 ml TBE na malou vaničku) a pustím všechen PCR produkt na gel (50 µl PCR produktu + 8 – 10 µl loadovacího pufru), nesmíme zapomenout, že je potřeba větší hřeben a mezi vzorky vynechat místo

o   Pokud provedeme krok  1, tak pak provedeme stejně uděláme krok 2

o   Do ELFO vany dáme nový TBE pufr (když není umíchá se 200 ml 5xTBE pufru s 1800 ml destilky, vyjde nám tím 0,5 TBE)

·         Vyřezání z gelu

o   Je nutno mít něco s dlouhým rukávem, aby nás UV světlo nepopálilo (pokud netoužíte po horském sluníčku). Od věci není ani vzít si štít na oči

o   Před vyřezáváním si skalpem dezinfikujeme ohněm (namočit v lihu a zapálit, pokusit se nezapálit stůl nebo podlahu.)

o   Vyřeženem, co nejpřesněji

·         Izolace DNA z gelu dle použitého kitu

·         Změříme koncentraci DNA na nanodropu

·         Ligační směs

       o   Ligační směs umícháme dle návodu níže (dvě možnosti)

o   T4 ligázu je nezbytné držet na ledu

1.       Pokud je koncentrace DNA malá:

Ligační pufr	5 µl
pGEM plasmidy	1 µl
PCR produkt	3 µl
T4 ligáza	1 µl

2.       Pokud je koncentrace DNA dostatečná

Ligační pufr	5 µl
pGEM plasmidy	1 µl
PCR produkt	1 µl
T4 ligáza	1 µl
Voda	2 µl

o   Necháme působit

§  1 hodinu při pokojové teplotě (a jdem v klidu na oběd)

§  24 hodin při 4°C přes nic (aneb dáme do lednice a jdem na pivo)

·         Výtěžek by měl být při této variantě vyšší

·         Přídání ligační směsi k buňkám (jenž otrocky zneužijeme)

o   Provedeme do 1,5 ml zkumavky

o   Dáme si špičky (200 µl a 20 µl nebo 10 µl do mrazáku)

o   Zapneme si termoblok na 42 °C

o   Vyndáme si kompetenční buňky na led a necháme rozmrznout

§  Buňky jsou náchylné na teplo, z ledu vyndávat jen na co nejkratší chvilku

o   Přidíme ligační (10 µl) směs k buňkám (bez bublin!!!)

o   Necháme 20 minut na ledu

o   Přeneseme na 45 sec. Na termoblok a buňky šokujeme

o   Vrátíme buňky na 2 minuty na led

·         Už nemusíme pracovat na ledu

·         Doplníme do cca 1 ml LB médiem

·         Necháme 90 minut třepat, 37°C na 220 RPM (při velké chuti na pivo stačí i 60 minut)

·         Během 90 minut si dojdeme na oběd a připravíme si plotny

o   Směs na jednu plotnu

IPTG (0,1 mol)	100 µl
Ampicilin	25 µl
XGAL	20 µl

·         Stočíme

o   10 minut na 5000 g

·         Odsajeme většinu supernatantu a zbytek resuspendujeme

·         Naneseme 100 – 200 µl na plotny a dáme do termáku, nejdřív víčkem nahoru a cca po 15 minutách otočíme a necháme buňky narůst přes noc

·         Vypícháme bílé kolonie do 10 µl destilky a dáme do cycléru a pustíme program LIKV (doplnit program LIKV)

·         Umícháme si master mix

o   Doplníme časem

·         Pustíme jakýkoliv program, klidně i  na LA, ale třetí teplota bude 72°C

·         Uděláme klasickou ELFO

·         Vypícháme zbytek kolonií, které vyšly na ELFO do 4 ml LB média + 4 µl Ampicilinu a necháme narůst přes noc na třepačce

·         Izolace plasmidu záleží na na použitím KITu

o   Do 1,5 ml zkumavky si dám narostlé bakterie a stočím, pak odsaju supernatant a opakuju ještě jednou, abychom získali víc plasmidů, pak resuspenduju

o   Dále dle návodu v KITu

·         Sekvenace

o   Mělo by tam být alespoň 400 µg DNA na reakci

o   Namícháme sekvenační směs a dáme sekvenovat

Založeno na Protokolu Tomáše Pánka